簡要描述：Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒采用MDA技術，可均一的擴增單個細胞（1至1000個細菌或腫瘤細胞）或純化的基因組DNA，能夠覆蓋基因組所有位點。擴增產物性質穩定，可達40 µg（產物平均長度大于>10 kb）。適用于二代測序等新技術應用。可用于癌癥、干細胞或宏觀基因組學（metagenomics）研究。

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Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒產品歡迎您致電 華雅再生醫學旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術有限公司 

產品原理

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒采用多重置換擴增（MDA，Multiple Displacement Amplification）技術，對所有基因組位點進行無偏差的擴增。與基于PCR的全基因組擴增技術相比，該技術具有更好的擴增保真度，避免出現假陽性或假陰性信號。

儲存條件：-20°C

質控

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒所有緩沖液和試劑生產都經過嚴格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實驗獲得可靠的結果。

安全信息

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒時，穿戴合適的實驗防護·服，一次性手套和保護手套。詳細信息，參見SDS。

適用樣本

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒可使用各種臨床和非臨床研究樣品，包括已純化的基因組 DNA（gDNA）、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。REPLI-g Single Cell 擴增后DNA 產物平均長度 >10 kb，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經開發用于新一代測序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或 qPCR 分析。

應用

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒適用于分子生物學應用。該產品不適用于疾病的診斷、預防或治療。推薦依據NIH發布的重組DNA實驗指南或其他指南使用所有Qiagen產品。

更詳細應用領域：

人 / 動物：生物標志物研究（SNP、突變、CNV），干細胞研究，循環胎兒細胞的分析（產前檢測篩查），嵌合研究，遺傳易感性研究，轉基因動物的分型。

癌癥：體細胞遺傳變異分析，腫瘤發展，腫瘤干細胞 / 進化，循環腫瘤細胞（CTCs）的分析

細菌：宏基因組學 (Metagenomics)，研究病原體分析，微生物基因分型。

植物 * ：氣孔研究，花粉分析。

* 無細胞壁的細胞或已純化的基因組 DNA。

下游應用及儀器

全基因組測序、外顯子組測序：新一代測序平臺 ?（Illumina等）

SNP 基因分型芯片、Array CGH：芯片平臺 ?

qPCR/PCR技術：實時定量 PCR/PCR 循環儀 ?

Sanger 測序：毛細管測序儀 ?

焦磷酸測序：PyroMark®（QIAGEN）

? 多個供應商

例：全基因組測序流程

細胞樣本/基因組DNA——樣本處理——REPLI-g Single Cell Kit擴增——新一代測序

組份規格

需要用戶自備材料

微離心管

水浴或其他加熱儀器

微型離心機

漩渦混合儀（Vortexer）

吸管和吸頭

冰

操作方法選擇

REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒需要根據起始樣本選擇對應操作方法

其他起始樣本：血漿血清、活檢、需要高通量擴增的樣本等參見其他對應說明書。

操作流程

方法*程

細胞樣本——加入變性混合液——65°C孵育10min——加入終止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴增DNA

方法二流程

純化基因組DNA——加入變性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴增DNA

方法一：從單細胞擴增基因組DNA

實驗開始前注意事項

1.適用樣本：1-1000個完整細胞

這個方法適用于所有物種的單細胞樣本，如：脊椎動物，細菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌），植物（細胞壁已脫），分選細胞，組織培養細胞和細胞。

不適用樣本：福爾馬林固定樣本或其他使用交聯劑固定的樣本，如：從福爾馬林固定石蠟包埋組織中激光顯微切割得到的單細胞樣本。

2.小心試劑不要被外源DNA污染。如：使用干凈獨立吸頭吸管，在無外源DNA地方進行反應操作。

3.純化基因組DNA擴增參見方法二。

4.聚合酶要在冰上解凍（見步驟6）。其他成分可以室溫解凍（15–25°C）。

5.配制的D2緩沖液（變性緩沖液）存放不要超過3個月。

6.陰性對照（無模板）的DNA產量約 40 µg。因為REPLI-g 的單細胞擴增反應中，引物二聚體的隨機擴增得到高分子量的DNA產物。這一DNA不會影響實際樣本質量，也不會影響下游分析造成陽性結果。

開始前準備

試劑預處理

1.DLB緩沖液加500µl試劑盒的水混勻，稍微離心溶解。

注意：重組的DLB緩沖液–20°C能放6個月。

Buffer DLB is pH-labile.

2.所有緩沖液和試劑使用前都要用漩渦混合器充分混勻。

儀器預設

3.水浴，heating block或熱循環儀溫度設為30°C。

如果熱循環儀帶加熱蓋，蓋子溫度設為70°C。

步驟

一 變性

1.按表1配制足量（整個擴增流程所需）D2緩沖液（變性緩沖液）。

注意：表中提供的D2緩沖液用量足夠進行12次反應。沒用完的D2緩沖液–20°C 存放，但不要存放超過3個月。

表1.D2緩沖液配制

2. 4 µl樣本細胞（含PBS）加入微離心管。如果細胞不夠4 µl，加PBS sc補齊。

注意：REPLI-g單細胞擴增試劑盒提供的PBS sc量不夠用于樣本細胞的連續稀釋。

可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）

3.加入3 µl 配制的D2緩沖液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。

注意：確保樣本細胞沒有貼在緩沖液線上的管壁。

4.65°C孵育10min。

1. 加入3 µl 終止液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。冰上保存。

二 擴增

6.冰上解凍REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室溫解凍，漩渦振蕩后稍微離心。

解凍后REPLI-g sc反應緩沖液可能會形成沉淀，漩渦振蕩10s可以溶解沉淀。

7.按表2配制master混合液。混勻，稍微離心。

要點：嚴格按照表2所列順序配制。加入水和反應緩沖液后，稍微漩渦振蕩和離心后再加入DNA聚合酶。

注意：一次性進行多次反應時，根據反應數量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。

表2：master混合液配制

多次反應，根據反應數量等比例增加劑量并增加10%。

8.每次反應，10 µl 變性DNA（步驟5）加入40 µl master 混合液。

9.30°C孵育8h。

30°C孵育后，水浴或其他加熱儀可以改設為65°C方便步驟10使用。

注意：如果使用帶加熱蓋的熱循環儀，蓋子溫度設為70°C。

10.DNA聚合酶65°C滅活3min。

擴增產物儲存

11.如果不直接使用，擴增所得DNA 短期儲存在4°C，長期儲存在–20°C。

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒的DNA可以當作基因組DNA（zui低凍融循環），因此推薦zui低核酸儲存密度為100 ng/µl。

注意：避免多次反復凍融以確保DNA質量。

下游應用樣本處理

12.依照說明書用水或TE適量稀釋擴增DNA。用于PCR分析的擴增DNA按1:100稀釋，每次PCR反應使用2 µl 稀釋后DNA。

13.擴增DNA可用于一系列下游應用，包括：第二代測序，array CGH和定量PCR。

注意：每50 µl典型反應的DNA產量約40 µg，需要正確稀釋。擴增DNA定量見附件A。

方法二：純化基因組DNA擴增

略。詳情參見原版說明書。中文版翻譯可咨詢紅榮微再。

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