間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的兩種滅菌方法

 　　間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強(qiáng)度小，成本較低，但易造成營養(yǎng)成分的流失，而且在多次加樣(無菌谷氨酰胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等)過程中容易造成二次污染。大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。下面就來介紹下過濾除菌。

　　間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的過濾除菌：

　　目前培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液包括人工合成培養(yǎng)液、消化用酶等，常含有維生素、蛋白質(zhì)、多肽、生長因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用過濾消毒以除去細(xì)菌。可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone(PES)、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。目前常用的濾器有Zeiss濾器、玻璃漏斗式濾器和針式微孔濾器。

　　其中，Zeiss濾器為不銹鋼的金屬結(jié)構(gòu)，中間夾有一層石棉制成的一次性纖維濾板。濾板具有一定的厚度，可承受一定的壓力，因此是過濾粘稠液體較理想的濾器。濾板有不同的規(guī)格，進(jìn)口的型號為EKS，EKS2，EKS3等。國產(chǎn)的有甲1、甲2、甲3等，其中以EKS3及甲3過濾除菌的效果較好，但因孔徑很小，過濾速度較慢。Zeiss濾器可分為抽濾式或加壓式 抽濾式濾器與抽濾瓶相連，真空泵抽氣形成負(fù)壓以過濾液體，其效率不如加壓式。由于抽氣造成負(fù)壓抽吸，操作使用時(shí)要防止倒流而引起污染，因此要注意避免將出、入管道接錯(cuò);停止抽氣時(shí)應(yīng)使用氣體緩慢回流，要先用止血鉗夾住抽氣管再關(guān)機(jī)，防止氣體回流。加壓式濾器的容器為密閉式，加入待過濾的液體后，通以氣體(常用N2、O2)，形成壓力將液體濾過，效果較佳。使用時(shí)注意壓力不能過大，不應(yīng)超過0.2kg/cm2。另外，由于使用的濾板為石棉，濾過的液體內(nèi)有時(shí)可能混有少許雜質(zhì)，因此在過濾前應(yīng)先以少量生理鹽水濕潤濾板。Zeiss濾器的清洗比玻璃濾器簡單，濾板屬一次性，使用后即可棄去，以自來水將金屬濾器初步?jīng)_洗，用洗滌劑刷洗干凈，自來水沖凈，蒸餾水漂洗2-3次，晾干包裝。消毒前將濾板裝好，旋鈕不要擰得太緊，消毒后立即將旋鈕擰緊以保證過濾除菌的效果。此外，也可在石棉濾板上加一層濾膜，以增加過濾效果。

　　玻璃濾器為玻璃結(jié)構(gòu)，以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上，可用于過濾各種培養(yǎng)液體。只能采用抽濾式。根據(jù)濾板孔徑的大小 分為G1-G6六種規(guī)格型號，其中只有C5及C6可用以過濾除菌，一般都使用C6型，但過濾速度較慢。玻璃濾器的使用方法與抽濾式Zeiss濾器相同，但清洗過程比較繁瑣。玻璃濾器使用后及時(shí)用自來水沖洗濾器表面的剩余物，然后用單蒸水浸泡，除去濾板內(nèi)堵塞雜物，若用濾膜則將濾膜丟棄，加4N鹽酸浸泡12小時(shí)以上，用自來水沖洗，再用單蒸水抽濾2次，雙蒸水(或去離子水)抽濾沖洗、包裝、121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。也可用5%的潔消精浸泡20分鐘后，再按上述方法沖洗和滅菌。

　　微孔濾膜濾器的基本結(jié)構(gòu)與Zeiss濾器相同，為金屬結(jié)構(gòu)，其中間為一種一次性的特制混合纖維素脂濾膜，可用于各種培養(yǎng)液體的過濾除菌，速度較快。效果較好，現(xiàn)已為許多實(shí)驗(yàn)室所使用。濾膜的規(guī)格很多，主要根據(jù)濾器的直徑大小而劃分型號，可接待過濾液體的量來選擇適當(dāng)?shù)男吞枴V過大量培養(yǎng)液時(shí)，一般多用直徑10cm(容器量為500ml)及直徑15cm(容器量為2000ml)兩種規(guī)格。用于小量培養(yǎng)液時(shí)，可選用2.5cm直徑濾器，以注射器推動(dòng)壓力而過濾。 濾膜的選擇是效果好壞的關(guān)鍵。有孔徑為0.6、0.45、0.22um三種濾膜，用以過濾除菌時(shí)，使用0.22um孔徑的濾膜(可以除去細(xì)菌和霉菌)。由于濾膜很薄，在濾器的上層和下層的相應(yīng)部位各有一凹槽以放置一硅膠墊圈來固定、壓緊濾膜。安裝濾膜時(shí)要注意，濾膜薄而且光滑，容易移動(dòng)。千萬不能裝偏而是過濾失敗;同時(shí)要注意濾膜的正反面，正面(光面)應(yīng)向上。由于濾膜薄，承受壓力有限，力量不能過大、過猛，以免濾膜破裂。大量培養(yǎng)液過濾通常裝上兩張膜，上面為0.45um，下面為0.22um。每次過濾完畢應(yīng)打開濾器，核實(shí)濾膜是否搖動(dòng)或破裂，以保證有效過濾除菌。微孔濾膜濾器的清洗、消毒方法和Zeiss濾器相同，濾膜使用后即丟棄。