外周血單個核細胞分離方法

測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。取得有活性的細胞應根據不同目的，采用不同方法，考慮1細胞純度；2細胞獲得量；3細胞活力；4使用方法的簡易程度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。 一 原理: 常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚蔗糖Ficoll-泛影葡胺UrografinF／H分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌W
水性高，平均分子量為
400,000，當密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
 二方法:
1. 在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank"s液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內分為三層，上層為血漿和
Hank"s液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、
中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶如下圖，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank"s液或RPMI1640，
1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。 單個核細胞濃度細胞數／1毫升細胞懸液＝ 4個大方格內細胞總數 ────────── × 10４×2稀釋倍數 4
6. 細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。 活細胞數 活細胞百分率＝────── ×100％ 總細胞數 用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。