想做好血液RNA-seq實驗？這些經驗請收好！

血液是一種信息量巨大、獲取方便且微創的樣本類型，廣泛用于診斷和臨床研究，以探索疾病的病理和生理機制以及療法的作用。全血轉錄組測序是一種基于RNA測序（RNA-Seq）的方法，可對全血進行深入的基因表達譜分析，深入了解全系統范圍內所有轉錄本的表達和豐度。高通量RNA-Seq技術的發展使我們能夠以較低的成本收集高質量的血液轉錄組信息，為發現生物標志物、了解藥物反應、病理和生理過程以及疾病的無創診斷帶來了革命性的變化。

外周血的優勢在于采集快捷，且可在大規模人群中實現。然而，一旦血液離開人體，問題就來了。傳統方法需要從全血中分離白細胞，再提取RNA，以解決血液中污染物的問題。如今，專門為制備血液樣本而開發的方案使我們能夠從全血中獲得高質量的RNA-Seq 數據。

什么是RNA-seq？ 

RNA-seq即轉錄組測序技術（Transcriptome sequencing），廣義的定義為：對細胞內所有RNA（包括rRNA/ tRNA/ mRNA等）進行高通量測序，狹義的定義為：對細胞內mRNA進行高通量測序，臨床檢驗實驗室指的一般為狹義的轉錄組測序。

血液樣本

任何血液轉錄組分析實驗的第一步都是通過靜脈穿刺或指針采血。從少量血液中獲取優質RNA的技術進步，如通過指針采樣，將使廣泛的研究成為可能，參與者甚至可以進行自我采樣。

血液RNA降解可能發生在采集、儲存和處理過程中，因此，血液排出體外后，必須防止或減少RNA降解。而血液RNA極易降解的原因之一是血漿中含有高濃度的RNA酶（RNase）。在一項研究中，血漿內的游離RNA僅在15 秒鐘就發生降解，導致無法進行實時PCR擴增，RNA酶的威力由此可見一斑。因此，在采集全血時立即抑制RNA酶的活性至關重要，這樣才能確保采集高質量的RNA，這對下游測序、生物標記物鑒定和疾病診斷至關重要。

為了降低RNA的降解，特別是在開展大規模血液轉錄組學項目時，我們建議使用專門RNA采血管收集血液，如PAXgene™全血RNA 采血管（BD, 762165）。該采血管含有能穩定 RNA 的專有試劑，能產生準確反映采樣時血液狀態的基因表達數據。

更重要的一點，采血管的樣本儲藏時間及RNA質量的穩定性，是大型多中心臨床研究的一個關鍵考慮因素。PAXgene全血RNA保存管（762165）內含能夠穩定體內基因轉錄性狀的抗凝劑。抗凝劑能夠減少RNA在體外的降解，穩定細胞內的RNA，并將基因誘導的水平降低到最小程度，被廣泛用于血液RNA樣本的保存。相關實驗證明，PAXgene™ 全血RNA 采血管中樣本在-80℃儲存7年后 ，提取的RNA 質量與產量均較穩定，樣本在-20℃中儲存11年后，RNA 質量與采集當天相比沒有降低。

另外，如下圖所示，在沒有珠蛋白耗竭的情況下，基因檢測率會降低。從血液中分離的RNA樣本中去除rRNA及珠蛋白mRNA，可釋放出更多寶貴的測序空間，并將測序讀數集中到最重要的部分。