細胞培養常見問題分析解決

細胞污染  

凡是對細胞生長有危害的成分或者造成細胞不純的異物都視為污染。細胞污染根據污染源可以分為化學污染，物理污染和生物污染。  

化學污染  

細胞培養所用到的培養基，水要高壓蒸汽鍋滅菌。其中，血清作為細胞培養中常用的培養基，血清存在潛在的化學污染，此外血清成分具有不確定性，血清對不同細胞的生長影響包括毒副作用等存在差異。  

物理污染  

物理污染，主要指放射線、溫度、振動、輻射等物理因素對細胞的破壞。如將細胞液培養基等暴露于放射線或紫外線下，會引起細胞代謝改變。恒溫培養箱的周圍存在能夠產生機械振動的設備，可能也會對細胞生長存在一定影響。  

微生物污染  

1.細菌：細菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細菌污染較易發現，在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培養液一般會在短時間內變黃，有時靜置的培養液不混，稍加震蕩，變會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現。  

處理：  

在培養液中加入相應的抗生素，能夠預防絕大多數的細菌污染  

保證器皿、水充分滅菌，空氣無菌，同時保證滅菌壓力。  

2、霉菌：霉菌的污染多數是白色念珠菌，曲霉菌，酵母菌等。霉菌污染后培養液短期內依舊清亮不變渾濁，倒置顯微鏡下可看見細胞之間有交錯的絲狀，樹枝狀菌絲，漂浮在培養液中。念珠菌呈卵圓狀，在細胞周邊生長。細胞被霉菌污染后，仍可生長，長時間細胞的活力狀態會變差。  

處理：先確定污染物的種類：細菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細胞與正常細胞系隔離，并對實驗中所用過的所有器皿工具消毒  

3、支原體：支原體的大小介于細菌和病毒之間，是一種獨立生活的微生物。對熱敏感，對一般抗生素不敏感。支原體的形態多變，多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細胞微絨毛相似。  

因國內的血清很多數都沒有做支原體陰性檢測，而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一。支原體污染細胞后，培養液輕微發生混濁．但細胞變化不顯著，在細胞逐漸的培養中，細胞會慢慢死亡。  

支原體污染檢測：  

熒光染色法：DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。  

解決：  

1.抗生素排除法：支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規使用的5倍濃度）作用24-48小時，再換入常規培養液，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素200ug/ml,四環素10ug/ml，卡那霉素50ug/ml。  

2.加溫除菌：支原體不耐熱，可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。將支原體污染的細胞放置41度中作用10小時可殺死支原體。因高溫對細胞本身也會產生一定影響，故熱處理前需先進行預實驗，確定對細胞影響最小而能大程度的殺死支原體的時間。  

4、黑蛟蟲：黑膠蟲污染后細胞中出現小黑點，高倍鏡下可看見不規則的運動。培養液渾濁不明顯，對細胞生長狀態無太大影響。  

解決：如果細胞出現黑膠蟲污染，可增加細胞的接種密度，提高細胞存活率。當細胞生長狀態很好時，黑膠蟲的數量會降低。細胞培養過程中堅持要每天換液，并用緩沖液沖洗，能夠大大降低黑膠蟲的數量，可最終消失，偶爾在鏡下可見個別小黑點，但整體細胞培養和后續的細胞轉染無影響。  

細胞培養箱染菌清洗方法  

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。  

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細胞暫時轉移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細胞。孵箱應定期清潔（2月左右）。  

其它培養箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。  

預防霉菌污染，可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線或雙抗；但細胞一旦污染，制霉菌素或放線或雙抗都無法彌補，舍棄被污染細胞，并將環境*消毒。如果所有細胞都污染，可能是整體系統污染，檢查所有培養基和器材，并重新滅菌。針對個別污染，首先考慮操作問題，注意操作規范。