質(zhì)粒提取過程中需要注意的細(xì)節(jié)

質(zhì)粒(plasmid) 廣泛存在于生物界，從細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人類機(jī)體中都含有。質(zhì)粒是細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體（或擬核）以外的DNA分子，存在于細(xì)胞質(zhì)中（但酵母除外，酵母的2 μm質(zhì)粒存在于細(xì)胞核中），具有自主復(fù)制能力，使其在子代細(xì)胞中也能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息，是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子。質(zhì)粒具有自主復(fù)制能力，使其在子代細(xì)胞中也能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。細(xì)菌質(zhì)粒是DNA重組技術(shù)中常用的載體。載體是指把一個(gè)有用的外源基因通過基因工程手段，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行增殖和表達(dá)的工具。將某種目標(biāo)基因片段重組到質(zhì)粒中，構(gòu)成重組基因或重組體。

目前有許多方法用于從細(xì)菌中提純質(zhì)粒 DNA ， 這些方法都主要包括有以下 3 個(gè)步驟：

1. 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長。

2. 細(xì)菌的收獲和裂解

3. 質(zhì)粒 DNA 的純化。

（一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長

從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中 (有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此。現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如 pUC 系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn) LB 培養(yǎng)基中生長到對(duì)數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時(shí)，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒 DNA 。然而，較長一代的載體 (如 pBR322) 由于不能如此自由地復(fù)制， 所以需要在得到部分生長的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)， 以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。 氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成， 結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制， 然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制， 在若干小時(shí)內(nèi)， 其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。 這樣，像 pBR ３２２－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素 μg/ml) 已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒 DNA 量，對(duì)于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。

（二）細(xì)菌的收獲和裂解

細(xì)菌的收獲可通過離心來進(jìn)行， 而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種， 這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、 有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。 選擇哪一種方法取決于３個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒 DNA 的技術(shù)。

1)大質(zhì)粒 (大于 15kb) 容易受損， 故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來。 將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和 EDTA 進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入 SDS 一類去污劑溶解球形體。 這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。

2)可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入 EDTA 后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌

暴露于去污劑， 通過煮沸或堿處理使之裂解。 這些處理可破壞堿基配對(duì)， 故可使宿主的線狀染色體 DNA 變性，但閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒 DNA 鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。

3)一些大腸桿菌菌株 (如 HB101 的一些變種衍生株 ) 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類， 當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。 糖類會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒 DNA 內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如 HB101 和 TG1 等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。

4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶 A 的大腸桿菌菌株 (endA+ 株，如 HB101) 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。 因?yàn)橹蠓胁荒?滅活內(nèi)切核酸酶 A，以后在溫育 (如用限制酶消化 )時(shí)，質(zhì)粒 DNA 會(huì)被降解。但如果通過一個(gè)附加步驟 (用酚：氯仿進(jìn)行抽提 )可以避免此問題。

(三)質(zhì)粒 DNA 的純化

常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒 DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體 DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán) DNA 分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與 DNA 結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀 DNA 的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限， 可繼續(xù)結(jié)合更多的染料， 直至達(dá)到飽和 ( 每２個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合１個(gè)溴化乙錠分子 ) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán) DNA 分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。 多年來， 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒 DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒。

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