illumina測序基本知識

個要給大家講的，是它這個flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流動池”。

我們來看這個圖片。圖片當中，我們看到一個象載玻片大小的芯片。這個芯片里面，是做了8條通道。在這個通道的內表面，是做了專門的化學修飾。它的化學修飾，主要是用2種DNA引物，把它（2種DNA引物）種在玻璃表面。

這兩種（DNA引物的）序列是和接下來要測序的DNA文庫的接頭序列相互補的。而且這2種引物是通過共價鍵，連到Flowcell上去。之所以要用共價鍵連到Flowcell上去，是因為接下來有大量的液體要流過這個Flowcell，只有有共價鍵連接的這些DNA，才不會被沖掉。這就是Flowcell。

文庫制作

再接下來，講一下文庫、和文庫的制作（過程）所謂的DNA文庫，實際上是許多個DNA片段，在兩頭接上了特定的DNA接頭，型成的DNA混合物。

文庫有2個特點，第1個特點，是當中這一段插入的DNA，它的序列是各種各樣的。第2個特點，它的兩頭的接頭序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做這個文庫，首先是把基因組DNA，用超聲波打斷。然后打斷之后，兩頭用酶把它補平，再用Klenow酶在3'端加上一個A堿基。然后，再用連接酶把這個接頭給連上去。

連好了接頭的DNA混合物，我們就稱為一個“文庫”。英文也稱作“library”。

橋式PCR

做好了Library之后，就要做橋式PCR了。橋式PCR，實際上是把文庫種到芯片上去，然后進行擴增，這樣的一個過程。

這個過程，首先是把文庫加入到芯片上，因為文庫兩頭的DNA序列，和芯片上引物是互補的，所以，就會產生互補雜交。

雜交完了之后，我們在這里面加入dNP和聚合酶。聚合酶會從引物開始，延著模板合成出一條全新的DNA鏈來。

新的這條鏈，和原來的序列是*互補的。

接下來，我們再加入NaOH堿溶液。DNA雙鏈在NaOH堿溶液存在下，就解鏈了。而且被液流一沖，原來的那個（模板）鏈，也就是沒有和芯片共價連接的鏈，就被沖走了。而和芯片共價連接的鏈，就被保留下來。

然后，我們再在液流池里加入中性液體，主要是為了中和這個堿液，在加入中和液之后，整個環境變成中性了。這時侯，DNA鏈上的另外一端，就會和玻璃板上的第二種引物，發生互補雜交。

接下來，我們加入酶和dNTP，聚合酶就延著第二個引物，合成出一條新鏈來；然后，我們再加堿，把2條鏈解鏈解開；然后，我們再加中和液，這時侯，DNA鏈會和新的引物雜交。再加酶，再加dNTP，又從新引物合成出新的鏈來。

連續重復這一過程，DNA鏈的數量，就會以指數方式增長。

制備單鏈

在橋式PCR完成之后，接下來要做的工作，就是要把合成的雙鏈，變成可以測序的單鏈。

辦法是通過一個化學反應，把其中一個引物上的一個特定的基團給切斷掉。

然后，再用堿溶液來洗這個芯片。這時侯，堿讓DNA的雙鏈解鏈，那根被切斷了根的DNA鏈就被水沖掉了。留下那根共價鍵連在（芯片）上面的鏈。

接下來，再加入中性溶液，然后在這個中性溶液里面加入測序引物。

正式測序

好，接下來正式的測序工作就開始了。

那么，在測序的時侯，加入進去的，主要是2個東西：一個是帶熒光標記的dNTP。而這個dNTP，它還有一個特點，它的3'末端是被一個疊氮基堵住的。

然后，再加一個聚合酶，聚合酶就會選擇：哪一個dNTP是和原來位置上的那個堿基是互補的，根據互補性原理，把這個dNTP合成到新的這個DNA鏈上去。

因為這個dNTP的3'端是被一個疊氮基團堵住了，所以，它一個循環只能延長一個堿基。然后，它就停在那兒了。

合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶給沖掉。

沖掉之后，就放到顯微鏡下，去進行激光掃描。根據發出來的熒光來判斷它是哪個堿基。

因為4種dNTP，它每一種dNTP上面標的熒光素都不一樣，根據紅、黃、藍、綠，它出來的哪種顏色，那么，就可以倒過來推出來，這個新合成上去的堿基，是哪種堿基。

因為新合成的堿基，是和原來位置（的堿基）是互補的，所以，又推出模板上那個堿基是哪個。

這一個循環完成之后，就加入一些化學試劑，把疊氮基團和旁邊標記的熒光基團切掉。切完了之后，3'端的羥基就暴露出來。

再接下來，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延長一個堿基。新延長完一個堿基之后，把多余的酶和dNTP沖掉，再進行一輪顯微的激光掃描，再讀一下這個堿基是什么。

不斷重復這個過程，可以重復上百次，到幾百次，就可以把上百個堿基，甚至更多堿基的序列讀出來。

讀Index

那么，什么是Index哪？是因為Illumina的評委會個測序量很大，往往一個樣本，用不了那么幾億條DNA。所以，科學家就想了一個辦法。在文庫的接頭上做了一些標記，每一個樣本，它有一個特定的接頭，每個接頭里面，它有一段特定的序列。

這段特定的序列，我們就稱為Index。也有人把它叫做Barcode，反正，表達的是一個意思：這么一段特定的序列，標記了樣本的來源。

那么，要讀這個Index的序列，先用堿把上面這根測完“Read1”的序列，把上面這根DNA鏈給解鏈掉。

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